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论文基本情况
作者单位：清华大学生命科学学院、安徽农业大学。
发表期刊情况：《Bioinformatics》，2020年影响因子：6.937。
代码链接： http://zhulab.org.cn/BERT-Kcr_models/
数据链接：http://zhulab.org.cn/BERT-Kcr_models/data
1. 研究背景
赖氨酸巴豆酰化（Lysine Crotonylation, Kcr）是蛋白质翻译后修饰（post-translational modifications，PTMs）一种重要的形式和调节蛋白质发挥生物学功能的重要方式，对发育、代谢、疾病等众多生理过程均起到关键的调控作用，改现象在2011年才由芝加哥大学赵英明教授研究团队发现，刊发于顶级期刊Cell杂志，属于较新的研究方向。针对该问题的研究主要通过实验和计算的方法，实验方法不但昂贵而且耗时。而计算方法可以高效、低成本地预测Kcr的位置。
2. 研究进展
3. 实验数据
3.1 赖氨酸巴豆酰化数据集
原始数据来源：来自于文章《Global crotonylome reveals CDYL-regulated RPA1 crotonylation in homologous recombination-mediated DNA repair》包含3734个蛋白质，14311个Kcr位点，使用CD-HIT设置序列识别阈值为30%去除冗余样本，得到9964个正样本，再从宫颈癌细胞（HeLa cells）获得相同数量的阴性样本。每个样品含有31个氨基酸，赖氨酸（K）位于中间，最终得到：
训练集：正样本为6975个肽（每个肽包含31个氨基酸）和负样本为6975个肽（每个肽包含31个氨基酸）。
测试集：正样本为2989个肽（每个肽包含31个氨基酸）和负样本为2989个肽（每个肽包含31个氨基酸）。
3.2 赖氨酸糖化和乙酰化数据集
测试集：正样本为2989个肽的Kcr位点（3.1测试集正样本），负样本为2556个肽的Kgly位点和1485 Kace位点。
Kgly数据集截图：
Kace数据集截图：
备注：这里的Kgly数据集和Kace数据集均为负样本
4. 实验方法
4.1 BERT特征编码
2017年BERT由谷歌的科学家提出，BERT通过在所有编码器层中使用注意机制对左右上下文联合条件作用，预先训练进行双向表示。它以一个单词序列作为输入，不断向上流动的编码器层堆叠。每一层应用自我注意，并将其结果通过前馈神经网络传递交给下一个编码器，如下图所示。
BERT模型的框架如下图所示：
4.2 分类器模型
深度学习方法：
- Bi-LSTM：一个包含128个隐藏节点并激活ReLU的全连接层，一个dropout率为0.2的dropout层，一个包含2个隐藏节点和softmax激活函数的全连接层，Adam算法作为优化器，损失函数选用交叉熵损失公式。
- CNN
- FFNN
机器学习方法：
- SVM
- RF
- XGBoost
5. 研究结果
5.1滑动窗口大小的选择
使用NLP模型对肽片段进行编码，需要将肽序列转换成以氨基酸为词的句子，作者使用kmer作为一个单词，其中k从1到7，具体过程如下图所示，其中1个氨基酸的窗口尺寸AUROC值最高为0.915。
5.2 不同BERT预训练模型比较
在所有预先训练的BERT模型中，选择了5个典型的模型对我们的模型进行再训练进行微调。
5种不同的BERT模型：
- BERT-Tiny：440万个参数，2个transformers层和128个隐藏的嵌入。
- BERT-Mini：1130万个参数，4个transformers层和256个隐藏的嵌入。
- BERT-Small ：2910万个参数，4个transformers层，512个隐藏的嵌入。
- BERT-Medium：4170万个参数，8个transformers层，512个隐藏的嵌入。
- BERT-Base：1.101亿个参数，12个transformers层，768个隐藏的嵌入。
梯度搜索得到每个模型的最优参数：
最优参数交差验证评估不同模型的性能：
结论：BERT-Mini, BERT-Small 和 BERT-Medium10折交叉验证的AUROC都是0.918.但是BERT-Mini模型较小，所以采用BERT-Mini作为最终的预训练模型。
预训练对模型的影响：
使用 Swiss-Prot蛋白质序列预训练五个BERT模型，然后采用训练集对模型进行微调，五个模型交叉验证的结果如下图所示：
结论： BERT-Medium-Prot和BERT-Base-Prot10折交差验证的为AUROC都是0.920,尽管BERT-Mini的QUROC为0.918，但是BERT-Mini模型较小，所以采用BERT-Mini作为预训练模型。
5.3 不同NLP模型比较
BERT和其他两个NLP模型fastText和ELMo。由于目前没有预先训练好的fastText模型，我们直接使用fastText软件，对我们的训练数据集进行训练，并基于10倍交叉验证测试预测性能。此外，ELMo具有预训练的模型，因此我们基于我们的训练数据集对预训练的ELMo模型进行再训练，提取特征，然后将其传递到两层密集网络中，输出二值分类结果。10折交差验证的结果如下表所示：
结论：BERT模型优于其他两个NLP模型
5.4 BERT模型的优化
transformers层数的影响：
结论：BERT可以从更高层次的输入序列中学习信息特征表示，层数越多能够更加有效的去除噪声，更好的表示蛋白质的特征，四层transformers的BERT-Mini模型能够更好的表示进行特征表示。
为了进一步分析序列信息如何通过BERT模型学习，我们提取并分析了每个序列不同层中不同头部的注意权值。由于进一步利用最后一层CLS令牌的嵌入进行分类，我们计算了其他31个令牌对CLS的注意权值，BERT-Mini模型整体注意力在四个不同的层次上权重如下图所示。
结论：四层transformers的BERT-Mini模型能够更好的表示进行特征表示，权值更加集中于中心残疾。
基于整个训练数据集的正负序列之间的Two Sample Logo图。计算了31个位置的整体注意权重与耗尽剩余频率之间的相关系数。相关系数分别为0.109、0.523、0.369和为四层，分别为0.629。
结论：序列信息可以在高层用注意力权重表示。
5.5 分类器的比较
将预先训练的BERT-Mini模型提取的特征，将得到的特征输入到SVM、RF、XGBoost、CNN、BiLSTM和FFNN六个分类器中，得到以下结果。
**结论：**综合分析BERT_BiLSTM能取得更优的结果。
从经过微调的BERT- mini模型中提取向量表示，然后将其输入到下游的深度学习层，从而对BERT编码器和下游的深度学习层的参数进行微调，得到下图结果。
结论：微调并没有能够提升模型的预测效果。
5.6 独立测试比较
为了进一步评估我们的模型的性能，我们将我们的模型的预测结果与其他几个Kcr站点预测器(如基于位置权重的方法)进行了比较。
结论：BERT-Kcr预测性能优于Deep-Kcr等四种工具。
根据BERT-Kcr (BERT_BiLSTM)等方法在独立测试集上的预测结果绘制ROC和PRC图：
结论：与其他先进的方法相比，我们的BERT-Kcr模型在检测蛋白Kcr位点方面显示出了令人印象深刻的预测和识别能力。
5.7 检验模型泛化能力
赖氨酸糖基化(Kgly)和乙酰化(Kace)位点作为负样本，独立检测数据中的赖氨酸crotonylation (Kcr)位点作为正样本，从而得到一个新的测试集，利用得到新的测试集测试Kcr训练的模型得到下图结果。
结论：新构造的测试集负样本的数据没有被模型学到，所以导致独立测试的结果差于5.6的结果，但是BERT-Kcr依然好于其他算法。
独立测试集和赖氨酸糖基化(Kgly)和乙酰化(Kace)位点作为负样本的比较。
6. 结论
- 利用BERT-Mini预训练模型提取特征，再用BiLSTM作为分类器来预测Kcr位点
- 微调对作者的工作并没有帮助
- 从其他更高的编码器层或更高的编码器层组合中提取特征，也可能在未来的努力中改进Kcr位点预测。
7. 启发
- 微调不一定能够提升最终的预测效果
- 对于深度学习可以尝试使用BiLSTM作为最终的分类器
- 通过Two Sample Logo map可视化领域信息的重要性