Identification of neoantigens for individualed therapeutic cancer vaccines
个体化治疗性癌症疫苗中新抗原的鉴定
在这篇综述中，我们填补了对T细胞识别新抗原的基本机制的理解和发现体细胞突变和癌症免疫治疗的新抗原预测的计算方法之间的空白，提出一种新抗原分类仿佛，基于抗原如何在特定临床环境下给予有效的抗肿瘤免疫来区分保护、抑制和忽略抗原
文献脉络：
新抗原的呈递和识别：
1、新抗原呈递
2、新抗原特异性T细胞反应的启动
3、TCR的多样性和简并性
4、新抗原驱动的免疫效应机制
5、免疫监视，免疫逃逸和免疫编辑
新抗原的分类
1、保护性新抗原（guarding neoantigens）
2、抑制性新抗原（Restrianed neoantigens）
3、免疫性新抗原（ignored neoantigens）
新抗原候选基因的预测
1、免疫生物学驱动的方法
1）转录表达
2）MHC 结合、稳定性和细胞表面呈递
3）与自身（野生型序列）的相似性和与病原体相关表位的相似性
4）TCR识别
5）基因突变的普遍性和不可或缺性
6）杂合性缺失
2、基于深度学习的方法
挑战
1、技术挑战
2、临床应用的挑战
展望
一、一些名词的解释：
新抗原：由肿瘤特异性突变产生的主要组织相容性复合体(MHC)结合肽。识别新抗原可以驱动癌症细胞免疫治疗，如免疫检查点阻断（ICB）和过继性T细胞转移疗法
免疫检查点阻断：?免疫检查点阻断 (ICB)正在改变许多癌症的治疗范式，其原理是通过阻断表达免疫检查点的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用从而来解除肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用。ICB最早被证明对转移性黑色素瘤患者有效，但现在这种治疗方法已扩展到其他类型和一些早期癌症当中。
过继性T细胞转移疗法：?即把治疗性T细胞转移到患者体内，在全球只在少数机构中使用。这使得一般人无法获得有效的治疗。这类治疗方案通常使用数十亿个CD8 T细胞，它们具有细胞毒性特性，可以杀死癌细胞。然而，在细胞培养中需要数周的时间才能生长出足够多的CD8 T细胞，以便在一次治疗中使用。
肿瘤过继性T细胞疗法（adoptive T-cell therapy，ACT）面临的一个巨大挑战是如何避免转移后T细胞的衰竭和死亡。为了解决这个问题，纪念斯隆-凯特琳癌症中心的科学家对MicroRNA（miR）库进行了筛选，发现miR-200c的异位表达可显着增强转移T细胞的寿命和抗肿瘤功能，并发现该作用是由EpCAM的上调驱动的。研究表明miR-200c-EpCAM路径可能是提高ACT抗肿瘤效果的新靶点。（Ref：?Ectopic activation of the miR-200c–EpCAM axis enhances antitumor Tcell responses in models of adoptive cell therapy）
共有新抗原Table1（主要组织相容性复合体(MHC)等位基因频率来自于美国国家生物技术信息中心(NCBI)的dbMHC数据库）
只有一部分突变出现在患者的HLA分子的背景下，并不是所有出现的突变都会引起免疫反应，被自发发生的T细胞识别的新表位仅反应了单个肿瘤中的1-2%的突变，同时，并不是所有的新表位在T细胞街道的肿瘤细胞杀伤和抗肿瘤方面的作用都是相同的。
肿瘤中有免疫细胞浸润，包括：树突状细胞（DCs）、巨噬细胞和B细胞，他们可以作为专业的抗原呈递细胞（APCs），树突状细胞还能够将内吞抗原传递到细胞质隔间，进行蛋白酶体降解并在MHC-I分子上呈现，这一过程被称为“交叉呈递”，对于启动和刺激抗原特异性细胞毒性CD8+T细胞至关重要
然而，无论是癌细胞还是肿瘤浸润性apc，都不能直接启动幼稚T细胞，幼稚T细胞的启动几乎完全发生在淋巴结(LNs)中，通过高度特化的淋巴结常驻树突状细胞，?激活幼稚T细胞需要高水平的抗原-MHC复合体和共刺激信号。一旦转换为记忆T细胞，它们可以被水平低很多的新抗原呈递激活。被激活的记忆T细胞和效应T细胞离开淋巴结，再迁移到肿瘤中，在有利的肿瘤微环境下，它们可以识别癌细胞表面或肿瘤内抗原呈递细胞表达的新抗原，行使控制肿瘤生长的多种功能。
中枢免疫耐受性：胸腺中自我反应性T细胞的消除，攻击自身组织、细胞及器官的T细胞
肿瘤抗原克隆性：肿瘤抗原克隆性对肿瘤抗原免疫原性有影响，一般来说克隆突变具有更高的免疫原性
LOH（杂合性缺失）导致某一特殊基因政策的两个成对等位基因出现不同的基因组变化，常反映丧失基因的一个等位基因的部分或全部基因组序列
LOH一般与肿瘤的抑制基因（例如TP53）有关，在两个等位?基因都存在时，会抑制 恶性肿瘤 的发生。而当一个等位基因明显异常或缺失时（另一个等位基因已经处于没有活性的状态）不再有抑制功能，细胞就转化为癌细胞
DC疫苗具有许多优势，首先DC细胞是抗原呈递细胞（APC），负责摄取、处理抗原并将其呈递给T细胞以激活免疫应答，新抗原只有在被APC吸收并呈递给T细胞后才能发挥抗肿瘤作用。其次，它把DC细胞当做载体，不受其它因素的限制，如DNA的整合效率、核酸酶的影响以及佐剂等。
异源免疫：由一种不相关的抗原引起的T细胞对一种疾病的条件称为异源免疫。
Neoantigen feautures：可用于新抗原候选基因进行排序的特征或算法
驱动基因：?驱动基因，是与癌症发生发展相关的重要 基因 ，找到驱动基因后癌症的治疗就事半功倍。在2012年的亚洲肿瘤大会上，广东省人民医院副院长 吴一龙 教授提出“驱动基因”这个概念。与 癌症 发生发展相关的重要基因称为驱动基因，驱动基因决定了这个癌症的最主要的原因。当驱动基因突变后，就会把癌细胞“驱动”起来
驱动基因预测软件：
目前这些预测软件使用的方法可以分为三大类：基于基因功能算法、基于突变聚类方法、基于频率的算法。
1.基于频率的算法：
基于癌症驱动基因比其他基因的突变频率较高这一原理，使用统计算法计算出高频突变频率高于背景突变频率的基因为癌症驱动基因，这类方法在现有报道中较为常用。
2.基于突变聚类的方法：
通过检测基因间显着聚集在氨基酸序列特定区域的突变的基因，发现可能的驱动基因。
3.基于基因功能的算法：
根据突变基因对应的蛋白信息构建基因突变有害性的评价模型，最终将有害性较高的基因认定为驱动基因。
此部分参考：
作者：Soliva
链接：https://www.jianshu.com/p/90f47d777056
来源：简书
二、工程个性化新抗原疫苗流程
新抗原疫苗接种的目的是通过诱导诱导肿瘤死亡的新生T细胞反应，并支持从无知向抗肿瘤免疫的转变，来恢复癌症免疫周期。
基于个性化新抗原的树突状细胞（DC）疫苗的临床应用，新抗原疫苗是一种非常有吸引力的癌症疫苗，除了单独用作疫苗外，DNA、RNA、肽和肿瘤裂解物也可以装载到DC细胞上。
当新抗原疫苗装载到DC细胞上，注射到患者体内，DC细胞即为APC呈递细胞，将新抗原呈递出来被MHC I、MHCII结合，然后呈递至细胞表面，被CD8+ T cell 或者 CD4+ T cell 识别
CD8+ T cell对肿瘤细胞进行降解杀死。
三、新抗原介导的肿瘤控制机制详解
垂死的肿瘤细胞释放新抗原，以细胞外液内的可溶性形式到达引流淋巴结(LN)，或通过迁移抗原呈递细胞(APCs)从肿瘤部位运输。备注：DC细胞注射疫苗应该是在这步产生作用
在淋巴结中，高度特化的树突状细胞(DCs)将主要组织相容性复合体I类(MHC-I)或MHC-II分子上的新抗原呈现给naiveT细胞进行启动和激活。
活化的新抗原特异性CD4+和CD8+T细胞离开淋巴结，进入肿瘤并发挥抗肿瘤活性
肿瘤微环境中的apc可以激活抗原特异性记忆CD4+和CD8+T细胞，包括交叉反应性记忆T细胞。
新抗原的呈递和识别：
1、新抗原呈递
2、新抗原特异性T细胞反应的启动
3、TCR的多样性和简并性
相同的新表位-mhc复合物可以与具有不同tcr的T细胞结合，这些tcr可能由分子上不同的α-和β-链组成
单个T细胞受体(TCR)识别多种肽-主要相容性复合体(MHC)复合物的能力，包括不一定具有同源性的和结构不同的表位
4、新抗原驱动的免疫效应机制
癌症疫苗的最终目标是通过启动新的新抗原特异性T细胞或通过激活已形成的T细胞来重新点燃癌症免疫周期，从而培养持续的适应性抗肿瘤免疫反应，直到肿瘤细胞被完全消除。
CD8+和CD4+T细胞通过同源抗原识别分泌IFNγ，诱导肿瘤细胞和APCs上MHC-I和MHC-II呈递的上调，从而进一步使新抗原的识别敏感。
T细胞诱导杀死肿瘤细胞后，新抗原从肿瘤细胞中释放，促进CD8+、CD4+ T细胞的产生，形成免疫循环。
5、免疫监视，免疫逃逸和免疫编辑
肿瘤的遗传进化是由具有适合度优势的克隆的选择所驱动的，免疫监测和肿瘤进展之间的动态相互作用导致不同克隆组成的原发性和转移性病变
克隆性对新抗原识别的影响：单个肿瘤疾病的每个病变（原发性或转移）由不同的亚克隆组成，每?个亚克隆可能为患者的新抗原基因?组提供不同的新抗原集
肿瘤可以通过上调PD1配体1(PDL1)87等分子的表达、转化生长因子-β(TGFβ)88或通过促进Treg细胞89的扩增，保护其免受新抗原特异性T细胞免疫来产生免疫抑制TME。
免疫监视：?正常细胞癌变的过程在基因组发生变化的同时，还会发生一系列表型的改变，如表达一些正常细胞沒有的肿瘤抗原。癌细胞的肿瘤抗原可以被免疫系统识别，启动免疫应答机制将其清除掉。这就是所谓的“免疫监视”作用.
免疫编辑：?根据免疫编辑理论，免疫系统不但具有排除肿瘤细胞的能力，而且还具有促进肿瘤生长的作用。癌细胞在机体内发生、发展是一个免疫系统与癌细胞相互作用的动态过程。在这个过程中，免疫系统在清除一些肿瘤细胞的同时，也对另一些肿瘤细胞的生物学特性（如肿瘤的抗原性）进行重塑（Reshape），也即所谓的“免疫编辑”。被免疫编辑过的肿瘤细胞恶性程度越来越高，对免疫攻击的抵抗力越来越强，直至最终摧毁机体的免疫系统，造成肿瘤细胞的恶性生长并扩散。
免疫逃逸：在疫苗中结合多种新抗原而不是依赖单一抗原可以减轻抗原丢失逃逸的风险。
?肿瘤的免疫编辑理论认为，免疫系统与肿瘤的相互关系可以分为三种不同的状态（Phase）。第一种称为“清除”（Elimilation）状态，免疫系统清除癌细胞，具有常规理解的免疫监视特征；?如果一些变异的肿瘤细胞逃过了免疫编辑的“清除”作用而存活下来，它们与免疫系统的关系就进入了第二种状态，即“平衡”（Equilibration）状态；?这种平衡状态是动态的，肿瘤细胞在免疫系统的压力下，其基因有可能会发生变化，这种基因突变产生的“积累效应”达到一定程度时，就可能打破平稳，使免疫系统与肿瘤的关系进入“逃逸”（Escape）阶段，?在这个阶段的肿瘤细胞可以产生一系列恶性表型，如不能表达MHC分子，或不能产生肿瘤肽
四、新抗原的分类
分类新抗原的一种方法是基于体细胞突变的类型，它产生了改变的表位，并定义了其分子特征
根据新抗原获得的相关性的临床环境来区分新抗原的，我们称之为“基于环境的”，以区别于通常的基于分子结构的分类，因为它需要对特殊的疾病和治疗背景进行解剖
综合来看，守护新抗原和限制性新抗原是个体化癌症疫苗应该包括的高度相关靶点，特别是治疗早期疾病或者作为辅助（adjuvant）疗法。被忽略的新抗原为新抗原疫苗提供了丰富和互补的靶点来源。这三种类型的新抗原都应该被纳入包含多种新抗原的癌症疫苗中，并且在临床试验中评估不同类型新抗原的功用。
1、保护性新抗原（guarding neoantigens）
保护新抗原的特点是，在缺乏免疫治疗的情况下，它们在肿瘤中的表达足以驱动临床相关的抗肿瘤免疫
保护性新抗原分为两类：强抗原：?在肿瘤细胞中高度表达，而且可以与MHC蛋白高亲和力结合并且形成稳定复合体的新抗原。这些特征会在原位瘤出现早期就激发强力的细胞毒性T细胞反应，抑制原位瘤的生长和转移,?第二种保护新抗原类型被预先建立的、交叉反应性记忆T细胞识别，临床相关的异源T细胞对新抗原的免疫预计在很大程度上是由记忆T细胞库和TCR对肽-MHC复合物的亲和力驱动的，而不是由突变肽的MHC结合亲和力驱动的
新表位与相应的非突变肽之间的主要组织相容性复合体I类(MHC-I)结合亲和力的差异，此指标有报道可能会是预测生存周期的因子
保护新抗原的一个潜在缺点是，它们在病程早期就被靶向治疗，因此存在早期免疫编辑的风险
保护性新抗原是根据其预后影响来确定的
2、限制性新抗原（Restrianed neoantigens）
抑制性新抗原：将被ICB（免疫阻断点）再活化T细胞识别的靶点命名为受抑制的新抗原
并不是所有在患者中自发产生的新抗原特异性T细胞都能够行使杀伤癌细胞的作用。有些针对新抗原的T细胞只有在接受免疫检查点抑制剂治疗之后才重新被激活。综述作者将这些T细胞识别的抗原归为限制性新抗原。
它们的抗原性弱于保护最高类型的新抗原，并且启动的T细胞不熟练或没有充分扩展以防止疾病进展
Antigen-pulsed migratory DCs 需要好几天才能从肿瘤部位到达淋巴结所在的LN-resident DC细胞。
抑制性新抗原是根据其对ICB等免疫疗法所传达的临床效益的预测性来确定的
致癌驱动突变通常是克隆性的，因为它们对肿瘤克隆体的生存至关重要，因此在免疫编辑过程中不太可能丢失。来自驱动突变的新抗原候选基因在对ICB有反应的患者中更为常见
3、被忽略的新抗原（ignored neoantigens）
自发性免疫原性的缺乏并不意味着这些针对这些被忽视的抗原的T细胞将不能促进肿瘤的排斥
事实上，在小鼠中进行的系统免疫原性研究表明，当作为疫苗抗原使用时，NGS在小鼠肿瘤中发现的15-40%的癌症突变诱导了强大的新生T细胞应答(CD4+多于CD8+应答)
我们建议对这些突变基因产物使用术语“被忽略的新抗原”，尽管它们出现在MHC分子上，但需要接种疫苗来诱导临床相关的T细胞反应
假设被忽略的新抗原的特征是中等水平的新表位呈递，低于幼稚T细胞的启动的阈值，但高于记忆T细胞的识别水平,它们可能与刺激低突变负荷肿瘤患者的多聚特异性T细胞反应特别相关。
并不是所有在患者中自发产生的新抗原特异性T细胞都能够行使杀伤癌细胞的作用。有些针对新抗原的T细胞只有在接受免疫检查点抑制剂治疗之后才重新被激活。综述作者将这些T细胞识别的抗原归为限制性新抗原。
五、新抗原候选基因的预测
1、免疫生物学驱动的方法
我们自己对新抗原特征的基准研究表明，目前还不存在用于准确预测免疫原性的关键大量可用数据集，而且数据集过于多样化且不标准化
2.转录表达
总之，这些数据支持了这样一种观点，即高转录表达与自发功能T细胞反应的高可能性相关，因此与受抑制的新抗原的预测高度相关。因此，各种研究使用基因表达对新抗原候选基因进行排序
在新抗原特异性疫苗和过继T细胞治疗的背景下，可以通过考虑较低转录表达的突变来扩大潜在靶点的范围
通常，只对肿瘤组织进行表达分析，而不对相应的健康组织样本进行表达分析，并且该突变的肿瘤特异性通过外显子组测序得到证实
3.MHC 结合、稳定性和细胞表面呈递
MHC binding:抗原特异性CD4+和CD8+T细胞的合作对于有效的抗肿瘤免疫至关重要,单独表达一个MHC-I新抗原是不够的，而且在肿瘤小鼠模型中，至少需要一个额外的MHC-II新抗原才需要有意义的抗肿瘤免疫。因此，个体化疫苗应结合预测会与患者的MHC-I和MHC-II等位基因结合的新表位。
与MHC的亲和力之外，新抗原-MHC复合体的稳定性也同样重要。更稳定的复合体可能提高复合体被T细胞识别的几率。
已发表的预测MHC结合亲和力的工具是通过湿实验室结合亲和力数据和/或通过质谱检测的洗脱配体进行训练的，例如NetMHCpan和MHCflurry
MixMHCpred只使用洗脱配体数据，预测了给定肽序列出现在细胞表面的可能性，并获得了比MHC结合工具更高的ROC结合工具，使用对实验验证的MHC-i结合表位进行ROC曲线分析
缺乏罕见的MHC等位基因的配体数据是一个局限性，并通过诸如NetMHCpan等工具解决了这个问题，它使用与更频繁的MHC等位基因的MHC序列同源性来推断潜在的配体偏好
MHC复合物与新抗原结合的稳定性：新表位-mhc复合物的稳定性被认为比结合亲和力更重要，因为更高的稳定性可能会增加复合物被T细胞识别的可能性，NetMHCstabpan软件进行稳定性预测
预测蛋白酶体裂解和通过TAP转运至内质网：NetChop、NetCTL，然而，由于预测MHC呈现的方法是在从MHC中洗脱的配体上训练的，这些配体已经经过了这些早期的处理步骤，因此结合裂解、运输和结合预测工具的价值值得怀疑。
4.与自身（野生型序列）的相似性和与病原体相关表位的相似性
新抗原序列与野生型序列的差异越大，出现高亲和力T细胞的可能性也越高。新抗原表位与病原体序列的相似性可能提高它们被常见病原体激活的已有T细胞交叉识别的可能性。
利用不同相似性假设的一种方法是使用基本局部对齐搜索工具(blast)搜索非突变的蛋白质组所产生的对齐分数来替代TCR结合能
5.TCR识别
TCR与肽-MHC复合物的相互作用：基于预测TCR与MHC结合的氨基酸侧链或者与TCR结合较高的肽-MHC复合物的稳定性（这个没看懂）
将TCR的氨基酸序列使用经网络，以预测给定的TCR与肽-mhc复合物的结合
使用人工神经网络预测的方法，TCR序列与给定的肽-MHC复合物的结合
另一种方法声称基于TCR序列预测TCR最有可能的同源肽-mhc靶点
然而，这些方法还不成熟，由于mhc-肽-tcr组合空间的多样性巨大，现有的实验训练数据不足以训练算法，它们在当前计算算法的极限下运行。
6.基因突变的普遍性和不可或缺性
癌症样本的克隆结构可以通过分析在PyClone或SciClone患者中发现的变异等位基因频率来评估
克隆和躯干突变（在肿瘤进化早期的突变）可能比亚克隆和分支突变更可取，因为它们允许解决肿瘤的异质性，并靶向具有潜在的更高适应度和肿瘤促进功能的肿瘤细胞
根据定义，驱动突变可以促进癌细胞的适应性，并被认为是稳定的。诸如COSMIC和DriverDB等数据库列出了已知的和经过功能验证的驱动基因
7.杂合性缺失
出现杂合性丢失（Loss of heterozygosity）的必需基因可能是非常优秀的新抗原疫苗靶点。如果一个必要的基因受LOH的影响，并从剩余的等位基因产生新抗原，肿瘤不能通过新抗原丢失逃逸，因为剩余的等位基因是肿瘤细胞存活所必需的
基因敲除和基因沉默研究提供了大约1600-2500个基因的列表，这些基因似乎对细胞存活至关重要，并可能有助于新抗原候选基因的优先排序。
8.基于深度学习的方法
为了预测表位与MHC分子的结合，我们探索了基于MHC结合分析数据训练的人工神经网络。根据来自单等位基因细胞系的高质量免疫肽群数据训练的神经网络在预测MHC-I和MHC-II结合方面显示出优异的性能。
此外，从肽-mhc相互作用的三维结构模型中得到的物理化学性质（例如，吸引和排斥能、氢键能和构象能）正被用于训练神经网络
六、挑战
1、技术挑战
biosamples as analytes
有证据表明，在原发性肿瘤中表达的保护性新抗原会从转移性病变中丢失
被忽略的新抗原不受选择压力的影响，即使在晚期疾病中，也可能在不同病变中更均匀地表达和保存，这与
更高的转移负荷和已建立的免疫抑制机制有关。
许多方案基于单个活检样本，这些样本可能既不能完全捕获所探测的单个肿瘤病变的异质性，也不能在寡转移或多转移疾病的情况下具有代表性。因此，由此产生的复合新抗原疫苗可能只代表患者病变中目标的一小部分，充其量只能产生混合的临床反应。但是多区域或者多病灶测序在临床上是非常困难的
可以通过解开肿瘤异质性并基于单次活检推断肿瘤的高阶组织的计算算法提供部分解决方案
样本的收集和存储方式：液体活检
Mutation Calling
比对、去燥
Data set availability and quality
数据不平衡
2、临床应用的挑战