BODIPY脂滴染色流式荧光检测
探究在RA和OA的刺激下BMEC脂滴分泌的变化情况，之前因为共聚焦在区域选择方面认为影响因素较大，所以此次选用流式直接查看整体的分泌情况
- 样品流水号对应设置浓度如下
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| OA100 | OA200 | OA300 | OA400 | OA500 | CON | OA50 | OA100 | OA150 | OA200 | CON |
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操作步骤如下
- 吸出培养基，PBS清洗两遍
- 400μL胰酶消化，1mL完全培养基终止消化，转移至1.5mL棕色避光EP管里
- 1000rpm离心5min，弃上清
- 每管加入1mL 1μg/mL的BODIPY室温避光染色15min
- 离心，弃上清，PBS重悬离心弃上清，洗两到三遍
- 400μL PBS重悬后上机
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流式下机数据处理
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在summit软件里导入
.fsc文件后（设置为英文路径），双击右侧如下标志，在analysis中打开需要设置的第一个样品
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第一步，调出细胞群
- 所有细胞：左列为x轴，右列为y轴，选择后双击蓝色空白处
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有荧光强度的细胞
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BODIPY-log荧光强度
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圈出细胞群，设门；
右键-Polygon-圈目标群
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图一设的门圈至（挪至图2双击）图二，接着图二用rectangle方形圈门右键
set gate移动至图三，图三则为圈到的信号强度。通过设门选取目的细胞，调整荧光信号形状对称性，去除杂信号等
-
设置好门后，在右侧菜单栏书本标志的
analysis中选出其他样本进行比对
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结果比较方法一
- 按照上述步骤将样本信息一一导出后结果如下可利用
Mean这一列的值做柱状图分析影响大小（我这次是预实验只是大概看一下所以没有设置复孔），如果浓度梯度有效果，配合共聚焦的荧光图一一对应放结果图里是最直观的
| 浓度 | 流水号 | Region | Count | % Hist | % All | Bounds | Mode Count | Mode | Mean | Median | Std Dev. | CV | CV (hm) | Skew |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| OA100 | 1 | Total | 17047 | 100 | 34.29 | (1.00,100000.04) | 1117 | 53.15 | 51.88 | 48.56 | 17.63 | 33.97 | 24.88 | 1.96 |
| OA200 | 2 | Total | 15495 | 100 | 22.92 | (1.00,100000.04) | 890 | 63.67 | 62.16 | 60.86 | 20.81 | 33.48 | 29.9 | 0.89 |
| OA300 | 3 | Total | 16151 | 100 | 28.42 | (1.00,100000.04) | 1032 | 53.15 | 54.81 | 53.15 | 17.05 | 31.11 | 29.92 | 0.9 |
| OA400 | 4 | Total | 15889 | 100 | 25.23 | (1.00,100000.04) | 899 | 60.86 | 65.18 | 63.67 | 22.2 | 34.06 | 34.09 | 1 |
| OA500 | 5 | Total | 15322 | 100 | 20.92 | (1.00,100000.04) | 788 | 55.6 | 56.09 | 53.15 | 21.57 | 38.45 | 36.64 | 1.2 |
| CON | 6 | Total | 19274 | 100 | 57.04 | (1.00,100000.04) | 1592 | 18.82 | 20.19 | 18.82 | 5.92 | 29.34 | 23.24 | 2.09 |
| RA50 | 7 | Total | 18653 | 100 | 53.38 | (1.00,100000.04) | 1121 | 33.84 | 35.57 | 33.84 | 12.62 | 35.48 | 31.28 | 1.99 |
| RA100 | 8 | Total | 18774 | 100 | 49.51 | (1.00,100000.04) | 1227 | 69.68 | 69.29 | 66.61 | 23.16 | 33.43 | 26.03 | 1.52 |
| RA150 | 9 | Total | 18642 | 100 | 60.15 | (1.00,100000.04) | 1382 | 55.6 | 59.44 | 55.6 | 18.63 | 31.34 | 23.24 | 1.7 |
| RA200 | 10 | Total | 18575 | 100 | 56.13 | (1.00,100000.04) | 1319 | 72.9 | 76.05 | 72.9 | 23.98 | 31.53 | 24.67 | 1.54 |
| CON | 11 | Total | 18917 | 100 | 43.65 | (1.00,100000.04) | 1504 | 24.67 | 25.55 | 24.67 | 7.51 | 29.38 | 23.24 | 1.69 |
结果比较方法二
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需要比对的样本按照上述方法（皆在Histogram下）一一从
Databases samples目录下双击样本拉进来，按照上面的步骤选出三幅图的横纵坐标，然后设门这一步为保持一致性直接复制对照组的“门”进行set（比如我这里6号是对照组，就直接复制的6号的框选区域），比如我这里前两幅图都圈了门则都要一一复制，接下来用这3组数据（6/3/5示例） -
注意：一组样本要用同一组门才有可比性（所以按照第一步直接复制粘贴门）
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结果如下
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因为我这里的目的是想看实验组与对照组相比，BODIPY的绿色荧光强度是否有变化（峰的偏移），所以在前面设门一致的条件下，将三个（这里示例用了三个）over在一起直接比较，以便直观看出。接下来进行overlay，左上角由Histogram切换到overlay之后，参照原来的第三幅荧光峰图，在
Log Area选项下选择BODIPY-Log…之后同前一样双击蓝色空白处，出现新的图表框（此时是空白），单击新图标框的左上角，选择添加数据Add Data之后，双击每一组数据的第三幅图，也就是荧光强度值进行添加，就在新图表框中出现了下面我框选出来的红绿紫三个峰
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over完成之后如下，与红色对照6号样本相比，3号和5号样本都出现了明显的峰向右偏移，荧光强度增强，legend同样可以单击左上角调出
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这个结果如果明显同样可以再做一个共聚焦一起看一下