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本期我们以一篇多组学研究揭示DNA甲基化在植物促生菌-植物-微生物互作关系中作用的文献案例来讲解多组学研究如何做，并对多组学研究分析方法和组学分子实验验证思路进行总结，一起来看看吧。
2022年02月24日，南京农业大学沈振国和蒋建东教授团队合作在期刊《Microbiome》（IF:14.65/1区）发表了题为“Long-term effect of epigenetic modification in plant–microbe interactions: modification of DNA methylation induced by plant growth-promoting bacteria mediates promotion process”的最新研究成果。该研究通过多组学分析探讨了植物、土壤微生物组、植物促生菌之间的复杂互作关系，发现植物促生菌（plant growth-promoting bacteria,PGPB）通过调控植物根际DNA甲基化而长效促进植物生长的新机制，首次提出PGPB-植物-微生物组互作的二阶段模型，为PGPB影响根际微生物组提供新的思路。
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标题：表观遗传修饰对植物-微生物互作的长效影响：PGPB诱导的DNA甲基化修饰介导促进过程
时间：2022-02-24
期刊：Microbiome
影响因子：IF 14.65/1区
技术平台： 16S rRNA 扩增子测序、宏基因组鸟枪法测序、WGBS、RNA-seq、qRT-PCR（易基因均可提供）
背景：
土壤微生物群被认为是下一次绿色革命的基石，而PGPB是微生物组工程的关键。然而，将植物有益微生物从发现到农业应用仍然具有挑战性，因为有益菌株与原生土壤中的植物间的互作机制在很大程度上还未知。越来越多的研究表明，微生物组引入的菌株通常会在土壤中被消除；而其他一些研究报告指出，使用PGPB作为接种物可以显著促进植物生长。这种矛盾表明需要更深入了解微生物诱导的生长促进机制。
材料方法
土壤：从表层土壤（0-15 cm深度）采集，去除植物碎片和石头，在实验室4°C储存直至使用。
菌株：芽孢杆菌属PGP5和节杆菌属PGP41（Bacillus sp. PGP5 and Arthrobacter sp. PGP41）。
实验设计：
将对照组（Ste）和经DNA甲基化抑制剂Zebularine（Zeb）处理的美洲陆商（Phytolacca americana）植物种至PGP5（接种菌株PGP5）、PGP41（接种菌株PGP41）和CK（灭菌）土壤中。所有处理一式三份进行。在接种后0,3,7,15,21,30天对植物和根际土壤进行取样。将样品在液氮中冷冻，保存在–80°C直至分析。
采用多组学方法对根际复杂互作关系进行综合研究。分别通过扩增子和宏基因组测序分析根际微生物组在分类学和功能水平上的变化。分别通过转录组和DNA甲基化测序分析根际根系在转录和表观遗传学水平上的变化。
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?实验设计示意图
结果：
研究人员展示了在去除土壤中的PGPB接种物后，PGPB诱导的长期植物促生作用，并探讨了外源接种物、内源微生物组和植物之间的三种相互作用，这是植物促生过程的关键要素。研究发现根际微生物组的组成主要受植物发育驱动，根系募集大大减弱了接种物对根际微生物组的影响。根际微生物组变化和根系接种物定殖都不是促进植物生长的必要条件。在根系接种后引起的DNA甲基化修饰会影响与PGPB诱导的促生相关基因表达，并且接种诱导的DNA甲基化模式变化大大削弱了植物促生作用。总之，结果表明PGPB诱导的根系DNA甲基化修饰介导了促生过程，并且这些修饰在从微生物组中去除接种物后仍具有此功能。
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关键图形：
（1）16S多样性分析表明根际微生物组组成主要由植物发育驱动
研究发现，根际微生物组的组成主要由植物的发育驱动，表明根际分隔可能对根际微生物组具有募集效应，其在根系与特定细菌之间形成密切关系后稳定了根际微生物组。
?图1：根系诱导的根际微生物组分类变化
（2）宏基因组分析表明由接种物引起的根际微生物组变化仅限于早期阶段
宏基因组分析深入了解根际微生物组之间的功能差异，结果表明接种处理诱导的根际微生物组的功能水平变化仅限于早期阶段。
?图2：根际微生物组的功能
（3）RNA-seq分析显示微生物诱导的根系基因表达变化选择性地维持到后期
研究人员利用RNA-seq来分析在接种和未接种土壤中生长的植物在早期和后期的基因表达差异模式。结合结果显示，在早期阶段检测到大多数差异表达基因（DEG），且在后期显著富集。结果表明微生物诱导的根系基因表达变化选择性地维持到后期。
图3：根际微生物组诱导的根系基因表达谱变化
（4）WGBS+RNA-seq分析揭示接种后的DNA甲基化修饰响应影响根系的基因表达
为检测接种是否影响根系中的DNA甲基化，研究人员进行了DNA甲基化的WGBS分析。结果表明，在植物与微生物的互作过程中，某些区域的DNA甲基化变化从开始到后期都保持不变。基于重叠的差异表达基因（DEG）和差异甲基化区域（DMR）联合分析基因表达变化和DNA甲基化水平之间的相关性。数据结果表明，在菌株PGP5/PGP41和P.americana植物之间的相互作用中，基因转录部分由DNA甲基化调控。
?图4：DNA甲基化谱变化和与基因表达的相关性
（5）qPCR等验证分析揭示DNA甲基化变化与接种诱导的P.americana生长促进相关
通过qPCR对 16S rRNA基因的拷贝数进行定量分析，结果显示两种接种物早期都存在于根际土壤中，后期从根际土壤中清除，没有接种物在根部定殖。通过荧光原位杂交（FISH）、绿色荧光蛋白（GFP）标记菌株和16S rRNA基因扩增进一步验证该结论。表明根际微生物组变化和根系接种物的定殖都不是植物促生过程所必需的。在根系接种后引起的DNA甲基化修饰会影响与PGPB诱导的促生相关基因表达，并且接种诱导的DNA甲基化模式变化大大阻碍植物促生过程。总之，结果表明PGPB诱导的根系DNA甲基化修饰介导了促进过程，并且这些修饰在从微生物组中去除接种物后仍具有此功能。
?图5：DNA甲基化抑制剂会阻碍接种菌株PGP41和PGP5诱导的P.americana促生
结论：
这项研究提出了一种新的机制，PGPB在根系诱导的DNA甲基化修饰介导了植物促生过程，而且这些甲基化修饰在接种物消亡后仍然具有促生功能。这为微生物-植物的互作提供了重要的新见解，并为植物微生物组工程提供新的策略，超越了“维持土壤中接种物持久性的”观点。
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图6：PGPB和植物之间由DNA甲基化和根系募集介导的两步互作示意图
易基因小结：
本研究通过16S rRNA 扩增子测序、宏基因组鸟枪法测序、WGBS、RNA-seq等多组学技术对根际复杂互作关系进行综合了研究。扩增子测序和宏基因组测序分析根际微生物组在分类学和功能水平上的变化。转录组和DNA甲基化测序分析根际根系在转录和表观遗传学水平上的变化。发现PGPB通过调控植物根际DNA甲基化而长效促进植物生长的新机制，为PGPB影响根际微生物组提供新的思路。
敲黑板！！！知识点
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易基因技术团队多组学关联分析方法总结
1. 直接关联
一个基因的功能元件甲基化情况影响该基因的表达。
? 重叠分析
? Pearson/Spearman 相关性分析
2. 模型关联
基于基因转录、蛋白质、代谢物等之间的上下游相互作用联系。
? 多元线性模型(multiple linear model)
3. 网络关联
基于分子功能和通路的富集性。
? WGCNA module correlation
? EMDN algorithm
? SNF algorithm
从关联走向因果：组学分子实验验证
基因表达相关的组学：
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基因敲除/抑制
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基因过表达
甲基化组学：
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甲基化酶基因的敲除与过表达
宏基因组（肠道菌群）：
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无菌动物模型
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粪菌移植
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参考文献：
DOI:10.1186/s40168-022-01236-9
文中部分图片来源于网络，侵删。
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多组学关联研究怎么做？ DNA甲基化组+转录组+宏基因组+16S研究思路?mp.weixin.qq.com
