【数据库】SRA数据库介绍及数据下载
1. SRA数据库介绍
NCBI - SRA（Sequence ReadArchive）数据库是NCBI用于存储二代测序的原始数据，包括 454，Illumina，SOLiD，IonTorrent等，这个数据库是可以免费无限制下载的。当然，也可以到EBI - ENA数据库直接下载fastq .gz文件。
根据SRA数据产生的特点，将SRA数据分为四类，这四种分类有一个层次关系，SRA数据库用不同的前缀加以区分。
数据的层级结构是：SRP(项目研究/Studies) → SRX(实验设计/Experiments) → SRS(样本信息/Samples) → SRR(测序结果集/Runs)
伴随数据库是project，层级是PRJNA → SAMN
注：runs表示测序仪运行所产生的reads。一个Study可能包含多个Experiment，Experiments包含了Sample、DNA source、测序平台、数据处理等信息。一个Sample也可能对应多个Experiments。
一般文章里面会给出数据地址，例如，根据文章的GSE号进入GEO数据库里面，就可以看到其对应的SRA数据库ID号。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE84498
测试数据
后续讲解采用以下文章的数据：
文章：Liu H, Murphy CJ, Karreth FA, Emdal KB, White FM, Elemento O, Toker A, Wulf GM, Cantley LC. Identifying and Targeting Sporadic Oncogenic Genetic Aberrations in Mouse Models of Triple-Negative Breast Cancer. Cancer Discov. 2018 Mar;8(3):354-369. doi: 10.1158/2159-8290.CD-17-0679.
文章下载地址：http://cancerdiscovery.aacrjournals.org/content/candisc/early/2018/02/14/2159-8290.CD-17-0679.full.pdf
数据地址：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRP115453
https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJNA398328?show=reads
(1) SRP开头的ID：PRJNA = SRP
文章如果提到其数据上传到了SRA数据库，那么就会给出SRP开头的ID。如：The sequencing data have been deposited in the NCBI Sequence Read Archive (SRA) database under the accession code SRP115453.
① 查看样本列表：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra?term=SRP115453，可以看到该数据集共有182个数据。
② 查看该project有哪些数据：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/?acc=SRP115453；数据共1.35 T，有点大。可以根据研究目的进行样本筛选，挑选样本后，点击"Accession List"键， 下载得到SRR List 储存在SRR_Acc_List.txt 文件中。点击Metadata即可下载测序数据的相应信息，存储在SraRunTable.txt文件中。
(2) PRJNA开头的ID：SAMN = SRS
PRJNA开头的ID等同于 SRP开头的ID。进入链接，可以看到发表的文章，以及涉及到的样本：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA398328；该项目一共182个样本。
查看每个样本的情况：
链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra?term=SAMN07504222；可以看到每个样本对应1个测序数据。SAMN开头的ID等同于SRS开头的ID。
当然，也有同一样本存在多种测序数据的情况，如：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra?term=SAMN05341212 ；该样本存在6个数据。
(3) SRX开头的ID
对于上例，每个样本6个数据的情况，还可以进入每个测序数据，如，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX1922019
(4) SRR开头的ID
最后是，查看测序数据本身的信息：
https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?run=SRR5934050
注：网页相应的位置均有链接可直接跳转到对应的数据页面。
2. SRA数据的下载
sra数据的下载可以通过网页端下载，但是比较不方便。可借助以下软件工具来进行下载。
(1) 使用Aspera Connect 软件下载
Aspera Connect (http://downloads.asperasoft.com/en/downloads/8?list) 软件，是IBM旗下的商业高速文件传输软件，与NCBI和EBI有协作合同，可以免费使用其下载高通量测序文件。下载完成后，本地用fastq-dump提取fastq文件，用sam-dump提取SAM 文件。
1) 下载并解压安装aspera
wget http://download.asperasoft.com/download/sw/connect/3.7.4/aspera-connect-3.7.4.147727-linux-64.tar.gz
tar -xvzf aspera-connect-3.7.4.147727-linux-64.tar.gz
bash aspera-connect-3.7.4.147727-linux-64.sh
2) 设置环境变量
echo 'export PATH=~/.aspera/connect/bin:$PATH' >> ~/.bashrc
source ~/.bashrc
# EBI-ENA数据的存放地址为 fasp.sra.ebi.ac.uk，ENA在Aspera的用户名是era--fasp。
3) 获取sra下载链接
EBI - ENA下载链接获取：https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJNA398328?show=reads；点击下图红框中的TSV，即可下载得到182个测序数据的下载链接。
原始数据：ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/srr/SRR593/008/
fastq数据：ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR593/008/
如：
- study_accession：PRJNA398328
- sample_accession：SAMN07504110
- experiment_accession：SRX3094195
- run_accession：SRR5933808
- tax_id：10090
- scientific_name：Mus musculus
- fastq_ftp：ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR593/008/SRR5933808/SRR5933808_1.fastq.gz;ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR593/008/SRR5933808/SRR5933808_2.fastq.gz
- sra_ftp：ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/srr/SRR593/008/SRR5933808
也可批量自行构建网址：
SRR593/008/SRR5933808/SRR5933808_1.fastq.gz为替换的路径掌握规律后可批量构建。
fastq
链接：ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR前3位/00最后1位/SRR号/SRR号_1或者2.fastq.gz
例如：ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR593/008/SRR5933808/SRR5933808_1.fastq.gz
sra
链接：ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/srr/SRR前3位/00最后1位/SRR号
例如：ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/srr/SRR593/008/SRR5933808
4) 使用ascp命令下载
Aspera用法如下：
ascp --help
# ascp [参数] 目标文件 保存路径
# -v verbose mode 实时知道程序在干什么
# -T 取消加密，否则有时候数据下载不了
# -i 提供私钥文件的地址
# -l 设置最大传输速度，一般200m到500m，如果不设置，反而速度会比较低，可能有个较低的默认值
# -k 断点续传，一般设置为值1
# -Q 一般加上它
# -P 提供SSH port，端口一般是33001
# export ASPERA_SCP_PASS=~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh
ascp -vQT -k1 -l 400m -P33001 -i ~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh era-fasp@ftp.sra.ebi.ac.uk:vol1/srr/SRR593/008/SRR5933808 ./ &
ascp -vQT -k1 -l 400m -P33001 -i ~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh era-fasp@fasp.sra.ebi.ac.uk:vol1/fastq/SRR593/008/SRR5933808 ./ &
#era-fasp是aspera在ENA的用户名，fasp.sra.ebi.ac.uk是固定下载地址，需要记住。
#数据默认存储在当前路径的SRR5933808目录下
(2) 使用sratoolkit中的prefetch命令下载
SRA Tookit 是NCBI 提供的下载软件，需要选择合适的版本下载安装。
下载地址：https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi?view=software
SRA Toolkit Documentation：https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi?view=toolkit_doc
Frequently Used Tools:
fastq-dump: Convert SRA data into fastq format
prefetch: Allows command-line downloading of SRA, dbGaP, and ADSP data
sam-dump: Convert SRA data to sam format
sra-pileup: Generate pileup statistics on aligned SRA data
vdb-config: Display and modify VDB configuration information
vdb-decrypt: Decrypt non-SRA dbGaP data (“phenotype data”)
1) 下载
wget https://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sdk/2.11.0/sratoolkit.2.11.0-ubuntu64.tar.gz
tar xzvf sratoolkit.2.11.0-ubuntu64.tar.gz -C ~/softwares
# 如有su权限，可直接下载：
su
apt install sra-toolkit
# 也可使用conda安装
conda install sra-tools
2) 配置环境变量
echo "export PATH=$PATH:YOUR_PATH/sratoolkit.2.11.0-ubuntu64.tar.gz/bin" >> ~/.bashrc
source ~/.bashrc
prefetch -h
3) prefectch命令下载数据
# prefetch下载的数据在home目录下的ncbi目录里。
prefetch SRR5933808 & #下载单个SRA文件
prefetch --option-file SRR_Acc_List.txt #下载多个SRA文件
默认下载的是sra格式数据，可以使用fastq-dump将sra转换为fastq了。
fastq-dump --gzip --split-3 SRR5933808.sra
# 也可以直接使用fastq-dump下载数据，下载之后直接即使fastq格式。
# 不过还是选择prefetch比较好，因为sra数据格式比fastq格式占用空间较小，下载速度快；另一方面，sra也方便断点续传。
# 直接利用fastq-dump下载数据
fastq-dump --split-files SRR5933808 SRR5933808/
4) 文件拆分及格式转换
fastq-dump --split-files SRR5933808.sra
fastq-dump --split-files SRR5933808
fastq-dump --gzip --split-3 SRR5933808
# --split-spot: 将双端测序分为两份,但是都放在同一个文件中
# --split-files: 将双端测序分为两份,放在不同的文件,但是对于一方有而一方没有的reads直接丢弃
# --split-3: 将双端测序分为两份,放在不同的文件,但是对于一方有而一方没有的reads会单独放在一个文件夹里
# --gzip: 输出文件为gzip压缩格式
注：当不确定到底是单端还是双端的SRA文件,一律用--split-3。
其他工具使用示例：
# ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/sra/data/smoke_test.sh
#!/bin/bash
echo "Public data dump started SRR4065643"
./fastq-dump SRR4065643
./fastq-dump --split-files SRR4065643
./sam-dump SRR4065643 > SRR4065643.sam
rm -rf SRR4065643*
./fasterq-dump SRR4065643
./prefetch --type any SRR4065643
rm -rf SRR4065643*
echo "Public data dump ended"
echo "Starting dbGaP with ngc"
./fastq-dump --ngc ~/prj_phs710EA_test.ngc SRR1219879
rm -rf SRR1219879*
./fasterq-dump --ngc ~/prj_phs710EA_test.ngc SRR1219879
./sam-dump --ngc ~/prj_phs710EA_test.ngc SRR1219879
./prefetch --ngc ~/prj_phs710EA_test.ngc SRR1219879
rm -rf SRR1219879*
echo "NGC test done"
(3) 使用SRA Explorer下载
由瑞典斯德哥尔摩的Phil Ewels开发的网页下载工具：https://sra-explorer.info/#
支持输入：GSE、SRA、SRP、PRJ、EPR，甚至直接通过物种+组织+测序技术搜索
即使一个SRX包括超过一个数据集的时候（多个SRR），也会返回结果，例如：SRX1067547包含两个run。
(4) 使用wget直接下载
找到数据下载链接后直接使用如下命令下载sra或者fastq数据。
wget -c -t 0 -O SRR5933809 ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/srr/SRR593/009/SRR5933809
wget -c -t 0 -O SRR5933809_1.fastq.gz ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR593/009/SRR5933809/SRR5933809_1.fastq.gz &
# -c -t 配合使用可以防止下载数据的过程中链接中断的问题，-O则可以指定下载路径和文件名。
(5) 使用SRAdbV2 R包下载
可以使用SRAdbV2 R包获取SRA数据：https://seandavi.github.io/SRAdbV2/articles/SRAdbv2.html
BiocManager::install('seandavi/SRAdbV2')
library(SRAdbV2)
# 使用SRAdbV2 首先需要创建一个 R6类-Omicidx
oidx = Omicidx$new()
# 创建好Omicidx实例后，就可以使用oidx$search()来进行数据检索
query=paste(
paste0('sample_taxon_id:', 10116),
'AND experiment_library_strategy:"rna seq"',
'AND experiment_library_source:transcriptomic',
'AND experiment_platform:illumina')
z = oidx$search(q=query,entity='full',size=100L)
# z = oidx$search(q="PRJNA398328",entity='full',size=100L)
# 其中，entity 参数是指可以通过API获得的SRA实体类型， size 参数指查询结果返回的记录数
(6) 批量创建链接，迅雷下载
获取SRR ID后，批量创建下载链接，粘贴到迅雷即可下载。
# 根据SRR_Acc_List.txt文件一键自动创建下载链接
cat SRR_Acc_List.txt|while read a ;do t1=${a:0:6};t2=${a:9:9};echo "ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/srr/$t1/00$t2/$a/$a.sra";done
# ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/srr/SRR593/008/SRR5933808
# ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/srr/SRR593/009/SRR5933809
# ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/srr/SRR593/000/SRR5933810
# ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/SRR593/008/SRR5933808/SRR5933808_1.fastq.gz
注：构造ftp链接后使用wget下载数据的缺点：依赖网络情况，速度较慢，容易出错。
参考阅读：
生信技能树 - 解读SRA数据库规律一文就够
生信技能树 - SRA数据库的数据并不一定要在SRA数据库下载
百迈客医学 - SRA数据下载的几种常见方法
生信星球 - 也许是最方便的SRA数据下载方式
基因学苑如 - 何下载生物数据（四）：SRA数据下载