基因测序3——三、四代测序技术来势汹汹，国产化仍在布局二代测序？
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导读
【行业分析】基因测序系列，将聚焦基因测序设备，系统分析一代、二代、三代基因测序设备的技术原理，代表厂家，仪器特点以及未来趋势。本篇介绍三、四代测序技术及对应设备特点，市场情况。同时分析国内对基因测序设备的探索现状及技术趋势。
二代测序方兴未艾，三代、四代测序已然来势汹汹。全球的科研、产业乃至资本力量都将目光投向了基因测序技术。
2014年，罗氏收购了纳米孔测序公司Genia Technologies， 2020年，罗氏宣布收购初创测序技术公司Stratos Genomics，以推进罗氏纳米孔测序仪的开发。罗氏在测序领域的探索和布局仍在继续。
而Illumina公司同样也不惜重金为其第四代基因测序技术进行布局。2018年11月，Illumina曾宣布计划以12亿美元的现金收购Pacific Biosciences，当时引起业内诸多关注，但因英国竞争和市场管理局（CMA）的介入，多方博弈之后，2020年1月2日宣布终止合并。
单分子测序
另一类非Sanger原理的DNA测序技术在2008年成为现实，这类基于单个分子信号检测的DNA测序被称为单分子测序 (single molecule sequencing, SMS)，或第三代测序 (third generation sequencing, TGS)。尽管从现在的进展来看，SMS还未能完全实现预期目标，但已经做出了许多重要的努力。这些新技术包括Helicos的tSMS，PacBio的SMRT等等。
tSMS（ture single molecule sequencing）
1、tSMS原理介绍
Helicos Bioscience (MA, USA) 于2008年推出的HeliScope单分子测序平台被认为是第一个商品化的第三代测序仪。其测序原理tSMS是由斯坦福大学的S. R. Quake等科学家提出的。tSMS是一种利用光学信号进行DNA碱基识别的边合成边测序 (sequencing by synthesis, SBS) 技术，HeliScope的文库制备相对简单，首先将待测DNA随机打断成约200bp大小的片段，然后在3’末端加上50bp带有荧光标记的poly(A) tail。无需进行PCR扩增文库退火形成单链，与芯片上固定的Oligo dT探针结合，利用poly(A)上的荧光标记进行精确定位。接下来依次加入4种Cy5荧光染料标记的单核苷酸，在DNA聚合酶的作用下与模板互补配对并延伸一个碱基，ICCD相机采集荧光信号。最后通过化学剪切去除荧光基团并清洗，进行下一轮反应。原理如图所示。
tSMS原理
tSMS技术能够实现单分子测序，主要依赖于高分辨率的ICCD相机，能够对单个分子产生的荧光信号进行识别。但是较弱的信号强度导致测序的读长较短，错误率偏高，尽管通过两次测序 (two-pass sequencing) 能够降低错误率，但同时也提高了测序成本和运行时间。
2、相关仪器
作为第三代测序仪的先驱的HeliScope单分子测序平台正美国Helicos公司的产品，它的出现真正实现了单分子测序。HeliScope可同时运行两个芯片，平均读长约为35bp，一次运行的数据产量可达30Gb左右。该测序仪的售价太高大约为99.9万美元，相当于第二代测序仪的两倍，同时运行成本相对较高，一个人类基因组的测序成本约为5万美元。2012年11月中旬，由于经营不善等原因， Helicos正式宣布破产。
SMRT（single molecule Real-Time）sequencing
1、SMRT测序原理介绍
单分子实时测序是Pacific Biosciences (CA, USA) 推出的一项专利技术。该方法采用四色荧光标记的dNTP和被称为零级波导 (zero-mode waveguides, ZMW) 的纳米结构对单个DNA分子进行测序。
这种ZMW是直径50-100纳米，深度100nm的孔状纳米光电结构，通过微加工在二氧化硅基质的金属铝薄层上形成微阵列，光线进入ZMW后会呈指数级衰减，从而使得孔内仅有靠近基质的部分被照亮。Φ29 DNA聚合酶被固定在ZMW的底部，模板和引物结合之后被加到酶上，再加入四色荧光标记的dNTP (A555-dATP, A568-dTTP, A647-dGTP, A660-dCTP)。
当DNA合成进行时，连接上的dNTP由于在ZMW底部停留的时间较长 (约200ms)，其荧光信号能够与本底噪音区分开来，从而被识别。荧光基团被连接在dNTP的磷酸基团上，因此在延伸下一个碱基时，上一个dNTP的荧光基团被切除，从而保证了检测的连续性，提高了检测速度。SMRT的测序原理如图所示。
与tSMS类似，因为单分子的荧光信号较弱，SMRT的单碱基准确率仅有87.5%，但由于错误是随机产生的，通过多重测序和校正，在10×的条件下，准确率可提高到99.9%。
2、相关厂家及仪器
到目前为止，PacBio公司基于SMRT测序技术共推出了三款测序仪，第一款产品PacBio RS在2011年正式发布并商用；2013年4月发布了升级版PacBio RS Ⅱ；SMRT的一大优势是超长的读长，PacBio RS II测序平台能够得到的最大读长为30Kb，平均读长约8.5Kb，是目前所有商品化测序仪中读长最长的。一个SMRT cell单次运行产生的数据量约为400Mb，一天能够产生最多6.4Gb的数据。
2015年2015年10月推出全新升级的三代测序仪PacBio Sequel测序系统。Sequel系统变得更加灵巧，身体体积和重量仅为原来的1/3，相对于Illumina Hiseq的体积也缩小11%，但是增大了SMRT Cell运作空间，大大提高了数据产出，减少测序成本。测序读长：平均测序读长达到10 ~ 18 kb，最长可超过60 kb；
PacBio公司仪器（左. Sequel；右. RS II）
据称，在2019年中国已成为PacBio第三代单分子测序仪装机量仅次于美国的国家，达到了120台。其中2017年，诺禾致源（Novogene）采购了10台Sequel系统用于全基因组测序、Iso-Seq以及靶向测序服务。中国测序服务供应商希望组（GrandOmics）于向PacBio采购了五台Sequel测序仪。2018年，深圳华大基因（BGI）BGI在拥有2台Sequel系统和一台PacBio RS II测序仪的基础上再次订购了10台Sequel测序仪。2018年底，中国科学院上海生命科学研究院2台Sequel测序仪，单台价格人民币3674500元。
纳米孔测序技术
1、测序原理
纳米孔测序技术（又称第四代测序技术）是最近几年兴起的新一代测序技术，不需要对?DNA?进行生物或化学处理，而是基于物理的原理进行测序，其简要原理是将经过提取的DNA的其实一条单链一端与一种特殊的蛋白连接并可控制序列进入速度的作用。每个纳米孔会结合一个核酸外切酶，孔内共价结合有分子接头。单链DNA或RNA分子通过纳米级的小孔时，由于碱基形状大小不同，引起孔内电阻变化，通过测到这些特征电流，就能够识别出通过小孔的DNA分子上的碱基排列。同时因为DNA两条单链相互连接，这样DNA的正义链和反义链可以依次通过纳米孔测序，它们组合成2D read，并可相互印证。测序原理见下图。
纳米孔测序技术原理
2、相关仪器
目前Oxford Nanopore公司推出的基于纳米孔测序技术的测序平台包括MinION、GridION和PromethION。（如下图）
Oxford Nanopore公司测序平台（来自Oxford Nanopore公司官网，和义广业整理）
MinION系列测序仪主打便携、即刻，仪器单重仅为450克，尺寸比手机大不了多少，可以在样品来源处进行测序。立即数据流式传输，可快速获得可操作的结果。仅可适用单个流通池，但单个流动池中50 Gb的数据50 Gb的数据生成短至超长（> 4 Mb）读数，以提供最终的实验灵活性。官网称可适用于整个基因组/外显子组、元基因组学、靶向测序、全转录组（cDNA）、较小的转录组（直接RNA）以及多路复用以获取较小的样本。
GridION测序仪可安装1-5个流通池，紧凑型台式设备（尺寸：宽370毫米，高220毫米，深365毫米），集成计算功能，可灵活适用于实验室。纳米孔读取呈现给他们的DNA或RNA的长度-从短到超长（最长> 4 Mb），多达250 Gb的数据* —实时流式传输，可立即进行分析。与MinION系列相比，适合更大的基因组或项目，整个转录组（直接RNA或cDNA）或者大量样品。
PromethION 24和PromethION 48测序平台最多运行24/48个可独立寻址的大容量PromethION流通池,每个流通池可50 Gb的数据。据称可实现人类基因组测序成本低于1,000美元。适应于更大的基因组或项目、人口规模测序、高度复用的小基因组或目标区域或者整个转录组（直接RNA或cDNA）。
尽管其技术具有巨大领先优势，但目前业内多数对该公司测序平台的测序准确度方面存疑，认为MinION测序方法存在非随机的测序错误。比如MinION不能很好处理长于6个核苷酸的同聚物的测序，同时缺少碱基修饰检测的内参训练。据报道目前MinION测序仪的测序准确率在92％左右。对于类似致病菌和可变剪切的发掘，这样的测序准确率可以满足需求。但是对于临床检测，通常read准确率需要达到99.99％。因此，据称Oxford Nanopore公司正要在测序相关的化学反应和碱基识别软件方面进行优化。
2019年初，牛津纳米孔技术公司公布他们推出的PromethION 24和PromethION 48测序平台，最佳日读取数据量为7.6 Tb，理论上最大数据量为15 Tb。并宣布开放订购，仪器使用免费，但用户必须支付每年2万美元的服务合同费用。根据订单类型和数量，流量单元的价格从625美元到2000美元不等，每次运行的试剂成本为99美元。
全球TMT2020年2月3日讯，在获得中国公共健康专业人员的支持并与他们进行合作之后，Oxford Nanopore已经向中国发运了另外200台MinION测序仪以及相关耗材。
目前，Oxford Nanopore公司已选择在2021下半年在伦敦证券交易所IPO，目前分析师对它的估值在40-70亿英镑之间。
国产化探索
现今，国内不少医院着手建立服务核酸检测需求的院内实验室，这部分医院接下来或考虑采购基因测序仪。据2021年有关报道，现阶段国内医院市场存量基因测序仪仅800台左右，并平均每年按照约100台的新增数量增长。根据国家卫健委统计信息中心披露数据，截至2020年3月底，全国医疗卫生机构数有100.9万个，医院有3.4万家。医疗卫生机构显然构成了基因测序仪厂商尚未开发的蓝海市场。
但相较于国外巨头的全面布局，但国内基因测序企业仍困在技术瓶颈中，整体上依赖于巨头的技术平台。基因测序产业链中，我国企业主要集中在技术门槛较低的中下游基因测序服务领域。
目前基因测序设备国产化主要有三种方式：
1) 收购国外企业并自主研发的方式，如华大基因于2013 年收购美国 Complete Genomics 公司，获取 CG 公司基因测序设备知识产权，在此基础上进行自主研发；
2) 合作开发OEM的方式，如贝瑞和康、安诺优达分别和 Illumina 合作开发 的基因测序仪 NextSeq CN500、NextSeq 550AR，达安基因和博奥生物 则分别与 Thermo Fisher 合作的 DA8600、BioelectronSeq40 等。
3) 自主研发方式，如紫鑫药业同中科院合作开发的二代测序设备 BIGIS 系列产品，华因康开发的基因测序仪HYK-PSTAR-IIA，华大智造自主研发的全新便携式基因测序系统 DNBSEQ E系列等。
从表中可以看出，达安基因、博奥生物、贝瑞和康、安诺优达以及泛生子虽为国产医疗器械，实质却是贴牌合作开发并无核心技术。吉因加和华因康自主研发第二代测序仪，虽已取证，但在市场上并无亮眼表现。
华大的第二代测序仪技术是于2013年收购自美国Complete Genomics公司，称为cPAL，是一种边连接边测序（sequencing by ligation, SBL）的技术，类似solid技术平台，有着读长短的天然缺陷。后历时2年，华大自主开发了DNA纳米球技术（DNB），组合探针锚定连接（cPAL）等一系列核心测序技术，其测序原理利用四种不同颜色标记的探针去读取接头附近的碱基，探针能够与DNA片段结合，T4 DNA连接酶连接探针和anchor，使探针稳定结合，从该探针携带的荧光基团的颜色来判断该位置是何种碱基。当一轮反应结束后，去除anchor-prob产物，重复上一轮步骤测序下一个碱基。
自2015年起，华大先后发布 BGISEQ-500、BGISEQ-50、MGISEQ-2000 和 MGISEQ-200，这四款测序仪涵盖了高中低通量，并且都已经获得 NMPA 认证，不仅在科研领域开始大规模应用，在临床医学领域也开拓着越来越多的应用。
2018 年10月，华大智造发布全球最强日生产能力的 MGISEQ-T7，单日数据量高达 6Tb，每日可完成60例WGS。
2019 年1月6日，在美国加州China Focus@JPM Week上，华大智造首席运营官蒋慧博士宣布华大智造国产基因测序仪全球装机量突破 1000 台，已在全球 16个国家获得使用，累计产生的运行数据达20Pb。华大测序仪在全球基因测序行业发挥着越来越重要的作用。根据华大智造招股书显示，基因测序仪业务板块2020年营业收入为6.15亿元，测序仪销售323台。
齐碳科技在其官网上线了其首款产品QNome-9604正式发布的消息，同时发布的还有测序芯片 QCell-3841 和测序试剂盒 Qeagen-8。据称，可以达到 150k 以上的超长读长，8小时稳定产出500M，适用于微生物检测、扩增子测序等快速灵活的使用场景。
瀚海基因自主研发的第三代基因测序仪的研发进展停留在2017年的8月6日，公司对外的宣告：“由南方科技大学贺建奎团队自主研发的第三代基因测序仪在深圳诞生，目前已完成小批量样机生产”。
回顾基因测序的发展史，技术的迭代推动着测序市场的变化，前沿技术不断成为新的刚需，一家测序公司会因一个核心技术而崛起。
测序成本，读长和通量是评估测序技术先进与否的三个重要指标。
第二代测序技术的优点是成本较之一代大大下降，通量大幅提升，但缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统偏向性，同时读长也比较短。
第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的，它的根本特点是单分子测序，不需要任何PCR的过程，这是为了能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误，同时提高读长，并要保持二代技术的高通量，低成本的优点。
第四代测序技术是真正实现单分子检测和电子传导检测相结合的测序方法，完全摆脱了洗脱过程、PCR扩增过程。虽然该方法具有检测速度快，成本低等特点，但也面临DNA易位速率过快，电流变化幅度较小，制备纳米孔材料的稳定性等造成的准确性的问题。
人们对于测序的最终期待是精准而又极低成本，从这个角度看测序技术还远未达到理想状态。国内外对于测序技术的研究还在继续，目前尚处于实验室阶段的技术，如固态纳米孔，电镜测序，蛋白质晶体管测序也同样值得期待。
参考文献：
【1】Harris TD, et al. Single-Molecule DNA Sequencing of a Viral Genome. Science 320: 106-109 (2008)
【2】Eid J, et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science 323: 133-138 (2009)
【3】PacBio官网
【4】Nanopore Sequencing: 20 Years Oncs, 2008, 9(1):387-402.
作者声明：感谢本文参考资料作者，文中观点仅供参考，不恰当之处还望包涵指正。
作者：俞利平