TITLE：Tracheal aspirate RNA sequencing identifies distinct immunological features of COVID-19 ARDS
译名：气管抽吸物RNA测序可识别COVID-19 ARDS的不同免疫学特征
期刊：NATURE COMMUNICATIONS
日期：2021年12月
下载链接：https://doi.org/10.1038/s41467-021-25040-5
研究介绍：
冠状病毒病2019（COVID-19）可导致急性呼吸窘迫综合征（ARDS），其特点是动脉血氧浓度低、肺泡损伤和肺部炎症反应失调。早期研究假设，COVID-19 ARDS是由“细胞因子风暴”驱动的，因为检测到COVID-19危重患者的循环炎症细胞因子水平高于轻症患者或健康对照者。然而，最近的研究发现，与其他原因导致的ARDS患者相比，COVID-19型ARDS患者的血浆细胞因子水平较低，这表明有必要了解COVID-19型ARDS的潜在机制。临床试验表明，地塞米松对COVID-19急性呼吸窘迫综合征患者的死亡率有显著降低，考虑到糖皮质激素的免疫调节作用，这意味着炎症失调在COVID-19病理生理学中发挥了作用。相比之下，在SARS-CoV-2爆发之前，皮质类固醇治疗急性呼吸窘迫综合征的临床试验结果既有好处，也有可能造成伤害。这些差异揭示了COVID-19 ARDS中独特的激素反应生物学，对发病机制和治疗具有重要意义。虽然有几项研究评估了SARS-CoV-29-12患者的宿主下呼吸道基因表达，但没有一项研究将COVID-19 ARDS与其他病因的ARDS进行比较。
研究目的：
对COVID-19或其他病因导致的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的成年危重患者以及无ARDS的对照组进行比较，了解COVID-19型ARDS的潜在机制，发现了COVID-19 ARDS的独特免疫学特征，揭示了COVID-19 ARDS中独特的激素反应生物学，对发病机制和治疗具有重要意义。
材料与方法：
材料：
包括COVID-19引起的ARDS（COVID-ARDS， 15例）、其他病因引起的ARDS （other-ARDS， 32例）或无肺部疾病引起的气道保护（No-ARDS，5例），其他ARDS病因包括肺炎、误吸、败血症和输血反应。
方法：
（1）宏基因组测序
收集TA（气管抽吸物）并将其与DNA/RNA shield 1:1混合以保存核酸。为了评估宿主基因表达并检测SARS-CoV-2和其他病毒的存在，对TA标本进行了RNA的宏基因组二代测序（mNGS）。
（2）宿主差异表达及通路分析
测序读数与kallisto40（v. 0.46.1；包括偏差校正）伪比对到由与人类蛋白质编码基因相关的所有转录本、细胞溶质和线粒体核糖体RNA序列以及ERCC序列组成的索引结果。genlevel计数使用R包tximport v.1.1441和scale-tpm方法从转录水平丰度估计中生成。使用Bioconductor.3.1242中的DESeq2.1.32.0进行差异表达分析。使用ardsetology设计公式建立了个体基因表达的模型。采用独立假设加权法(IHW v.1.20.043,44)，Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR）< 0.1来确定显著基因。使用apeglm v.1.14.045拟合对数2倍变化的经验贝叶斯收缩估计。通过绝对对数2倍的变化生成了前50个差异表达基因的热图。基因表达使用方差稳定转换、居中和z轴缩放进行归一化。使用pheatmap v1.0.12生成热图。患者采用欧氏距离进行聚类，基因采用曼哈顿距离进行聚类。使用独创性途径分析差异表达基因（FDR < 0.1；log2> 0.5）。
（3）典型通路分析和药物/细胞因子上游调控因子分析
为了评估来自基因表达数据的信号通路和上游转录调节因子，使用了IPA。IPA上游调节器分析用于识别潜在的药物和细胞因子调节器，并根据调节器与其已知靶标之间的预期效应预测它们的激活状态，Ingenuity数据库（IKB）中注释的基因或蛋白质。Z-score表示通路内基因或已知上游调控靶基因的表达变化是否与IKB中先前发表的分析结果一致。显著通路和上游调控因子定义为Z-score绝对值大于2或重叠P值<0.05的通路。
（4）细胞类型比例的分析
使用CIBERSORT X算法从大量宿主转录组数据估计细胞类型比例。使用人类肺细胞图谱数据集来推导单细胞特征。使用Mann-Whitney-Wilcoxon检验（双侧）和 Bonferroni 校正比较三个患者组之间的估计比例。
（5）通过mNGS对SARS-CoV-2病毒载量进行量化
所有样本均通过基于SARS-CoV-2参考的组装管道进行处理，包括移除可能来自人类基因组或RefSeq中Kraken2 v.2.0.8_beta注释的其他病毒基因组的reads，然后使用minimap2 v.2.17将剩余的reads与SARS-CoV-2参考基因组MN908947.3进行比对。计算SARS-CoV-2每百万读数（rpM），方法是将与mapq≥20的病毒对齐的读数除以样本中的总读数。
（6）单细胞RNA测序和转录组分析
在血细胞计上用台盼蓝手工计数细胞，使用V（D）J v1.1试剂盒，将样品装载在10× Genomics Chip a上，不进行多路复用，目的是捕获10，000个细胞（10× Genomics）。文库在Illumina NovaSeq 6000上进行了150个碱基对的配对测序。数据使用Scanpy v1.648进行处理和分析。基因少于200个或超过30000个的细胞被过滤。去除线粒体基因，使用Harmony v0.1.449进行多样本整合。
（7）与外部数据集的比较
因为没有公开的下呼吸道RNA-seq数据来比较COVID-19相关的ARDS与其他类型的ARDS。因此，本文将COVID-ARDS和非ARDS受试者的基因表达差异与之前发表的三项研究进行了对比，并将COVID-ARDS患者与对照组进行了比较。从基因表达Omnibus（GSE155249）下载数据，使用DESeq2和apeglm来识别差异表达的基因。使用ToppGene suite50对数据集和每个外部数据集中FDR < 0.1的差异表达重叠基因进行功能富集分析。
（8）TA和NP样本中ISG计数与病毒载量的回归分析
基于MSigDB51中的“Hallmark干扰素-α反应”基因集组装了一组100个干扰素刺激基因。然后，对使用R包limma生成的分位数归一化基因计数（log2标度）与SARS-CoV-2 的log10（rpm）进行稳健回归。使用 R 包robustbase v.0.93.6 进行线性回归的MM型估计器。模型预测是使用R包ggeffects v.0.14.3生成的，并用于在单个基因图中显示。使用ggplot2 v.3.3.3生成图。误差带代表每个预测周围的正态分布95%置信区间。报告的回归系数与0的差异显着性P值基于t统计量和Benjamini-Hochberg调整。
结果：
图1 COVID-19 ARDS下呼吸道转录特征。
（a）通过调整P值，在COVID -19相关ARDS患者（COVID-ARDS，红色）与其他病因导致的ARDS对照组（Other-ARDS，紫色）之间绘制了前50个差异表达基因的热图。无ARDS的插管对照组也被纳入无监督聚类（No-ARDS，灰色）。（b）与COVID-ARDS相比，Other-ARDS和No-ARDS样本中选定通路的IPA的Z-score。（c）相对于COVID-ARDS患者，其他和非ARDS患者中上游细胞因子、PTEN和PI3K的激活状态预测。（d）与IPA药物转录特征数据库中发现的其他ARDS患者（紫色）或非ARDS患者（灰色）相比，预测药物可以缓解COVID-19 ARDS的宿主反应失调。G-CSF粒细胞集落刺激因子，EPA二十碳五烯酸，DHA二十二碳六烯酸。
图2 COVID-19急性呼吸窘迫综合征的细胞图。
（a）使用肺单细胞特征从气管抽吸体RNA测序数据中对细胞类型进行解卷积。框内的水平线表示中位数，上下铰链分别对应第一和第三个四分位。对两组患者进行两两比较，进行双侧Mann-Whitney-Wilcoxon检验，然后进行Bonferroni校正（n = 15例COVID-ARDS， n = 32例Other-ARDS， n = 5例No-ARDS）。（b）UMAP显示了从TA标本的scRNAseq获得的COVID-19 ARDS的免疫细胞景观。插图显示细胞型比例（n = 6， COVID-ARDS组）。柱状图表示中间值，误差柱分别表示四分位范围。Mac肺泡巨噬细胞，mDC单核细胞来源的树突状细胞，RBC红细胞。
图3与其他病毒或细菌下呼吸道感染相比，COVID-19引起的ARDS的下呼吸道转录特征。
（a）通过调整P值，绘制了covid-19相关ARDS患者（COVID-ARDS，红色）与病毒性LRTI所致ARDS患者（病毒性ARDS，蓝色）之间top差异表达基因的表达的热图和聚类图。（b）热图描绘了COVID-19相关ARDS患者（COVID-ARDS，红色）与细菌LRTI导致的ARDS（Bacterial-ARDS，绿色）之间的前50个差异表达基因的Z-score表达和聚类。（c）基于差异表达基因的通路分析，以IPA的Z-score相对于COVID-ARDS基因表达基线描述信号通路的相对表达。（d）与COVID-ARDS患者相比，病毒或细菌LRTI导致的ARDS患者中上游干扰素的激活预测显示，与其他病毒LRTI相关的ARDS相比，COVID-ARDS中i /III型干扰素的下调。
结论：
本研究报告了来自52名COVID-19或其他病因的ARDS危重患者以及没有ARDS的对照的气管抽吸物的比较下呼吸道转录分析结果。观察到与其他原因导致的ARDS相比，COVID-19 ARDS中的促炎基因表达减少。COVID-19 ARDS的特点是宿主反应失调，PTEN信号增加，炎症和免疫中具有非典型作用的基因表达升高。基因表达分析确定了几种可能调节COVID-19 ARDS中基因表达的候选药物，包括地塞米松和粒细胞集落刺激因子。与其他类型的病毒性肺炎导致的ARDS相比，COVID-19的特征是干扰素刺激基因（ISG）表达受损。与轻度COVID-19患者相比，COVID-19 ARDS患者的SARS-CoV-2病毒载量与ISG表达之间的关系是不相关的。总之，对患者下呼吸道宿主基因表达的评估揭示了COVID-19 ARDS的不同免疫学特征。
